Metode In Silico (Molecular Docking)

Molecular docking menggunakan Autodock 4 dikarenakan memiliki beberapa keunggulan dibandingkan Autodock Vina 1.1.2 diantaranya adalah dapat melihat Cluster Rank, konstanta inhibisi, dan residu asam amino yang diperoleh. Sebelum memulai proses molecular docking, terlebih dahulu kita harus mengetahui target aktivitas. Misalkan target saya untuk aktivitas anti-inflamasi pada iNOS. Tentu reseptor (protein target) yang saya cari juga spesifik untuk inflamasi pada iNOS tersebut. Setelah itu, mencari senyawa uji berupa metabolit sekunder dari tumbuhan maupun hewan yang telah dilaporkan memiliki aktivitas anti-inflamasi secara in-vitro dan in-vivo, dari hasil sintesis senyawa, serta berdasarkan data empiris dari masyarakat yang secara turun-temurun telah menggunakan bahan obat tersebut.

Selain itu, kita perlu mempersiapkan hardware dan software yang digunakan untuk proses molecular docking, diantaranya :

Hardware, laptop dengan spesifikasi minimal intel CORE i5; memori 16 GB; dan hardisk yang ditandem SSDi (jika kita memiliki spesifikasi laptop hanya intel inside tidak menjadi masalah. Hal ini karena proses molecular docking tetap dapat dilakukan akan tetapi membutuhkan waktu yang lama. Ini seperti punyaku. Hehehe... Akhirnya demi kebutuhan riset, aku membeli laptop dengan spesifikasi intel CORE i5 10TH GEN. Proses running senyawa uji terhadap reseptor dapat dilakukan lebih dari 10 senyawa dan membutuhkan waktu rata-rata 3-4 jam tergantung struktur molekul).

Software, ChemDraw Ultra 12.0; Chem3D Pro 12.0; Discovery Studio 2016 Client®, AutoDock Tools 4.2 (dapat kalian download disini: https://drive.google.com/drive/folders/1AXsLUyzzMNUzPUcq_fZImi8zIZK9yxWi?usp=sharing ).

 

• Mencari Reseptor

Protein target (reseptor) diperoleh dari PDB (Protein Data Bank) yang kode PDB nya dapat diperoleh ketika kita membaca dari jurnal yang telah menggunakan reseptor tersebut. Protein target yang saya gunakan sebagai reseptor pada iNOS dengan kode 3E6T.

Video 1. Mencari kode PDB dari protein target di jurnal

Setelah kita mengetahui kode PDB tersebut, maka dapat didownload pada https://www.rcsb.org/search dalam bentuk "PDB Format". 

Video 2. Mendownload protein target melalui PDB

Note: Ketika kita mencari reseptor yang diperoleh dari jurnal, kita pun harus memperhatikan nilai resolutionnya juga yaaa karena akan dibandingkan antara hasil kristalografi dengan re-docking. Nilai yang disyaratkan ≥ 2Å yang artinya semakin besar resolusi, maka banyak protein yang hilang. Sebaliknya jika semakin kecil nilai resolusi berarti banyak protein yang ada.

• Preparasi Reseptor dan Ligan Alami (Native Ligand)

Proses preparasi reseptor dan native ligand dilakukan menggunakan Discovery Studio 2016 Client®. Terlebih dahulu didelete molekul air, kemudian memilih reseptor atau native ligand dan disimpan dalam format Protein Data Bank Files. Jika reseptor maupun native ligand memiliki chain lebih dari satu (hal ini menunjukkan pencerminan), misal chain A dan B maka kita dapat memilih salah satu dari chain A atau B. Chain pada reseptor atau native ligand ini dapat kita lihat dengan teliti di https://www.rcsb.org/search ketika mendownload. 

Note : Untuk native ligand dapat kita pilih dengan seksama dan merupakan obat yang telah digunakan secara umum ataupun prototipe (disarankan obat yang secara umum telah digunakan ketika mencari kode PDB). Pastikan bahwa kita tidak salah memilih native ligand karena bisa saja yang kita pilih adalah pelarut yang ikut ketika proses kristalografi hasil penelitian. Kalian dapat pula membaca jurnal terlampir agar lebih memastikan bahwa benar native ligand dipilih bukan pelarut.

Kemudian kalian jangan lupa membuat folder khusus untuk proses docking yaaa agar jangan membingungkan ketika mencari letak folder.

Video 3. Preparasi reseptor dan ligan alami (native ligand) 

• Preparasi  Reseptor di Autodock Tools 1.5.6

Selain dilakukan di Biovia Discovery Studio, dilakukan pula pada Autodock Tools. Stepnya dimulai dari menu edit, kemudian charges (Add Kollman Charges) lalu hydrogens (add kemudian polar only) dan pilih grid, macromolecule, choose lalu klik reseptor dan pilih Select Molecule untuk save dalam format pdbqt.    

Note : Untuk memudahkan kita langsung tertuju pada file yang ingin dikerjakan dapat dicopy nama folder, kemudian dipaste pada Startup Directory yang tersedia di menu Preferences. 

Video 4. Preparasi reseptor di Autodock Tools 

• Preparasi Ligan Alami di Autodock Tools 1.5.6

Preparasi dimulai dari menu edit, kemudian charges (Compute Gasteiger), hydrogens (add, All Hydrogens, dan Merge Non-Polar). Setelah itu edit (delete, delete hydrogens. Ini dilakukan jika masih ada tanda putih di ujung-ujung suatu ligan, maka perlu dilakukan namun jika tidak ada tidak dilakukan lagi). Kemudian milih menu Ligand, input, choose, lalu Select Molecule for Autodock4). Lalu menu Ligand lagi, Torsion Tree, Choose Root, Detect Root, Choose Torsions, dan Set Number of Torsions serta output (Save as pdbqt).

Video 5. Preparasi ligan alami di Autodock Tools

       

Note : Untuk melakukan delete pada reseptor yang telah dipreparasi dan digantikan dengan preprasi ligan dilakukan dengan klik menu edit lalu delete (delete All Molecules).

• Mengatur Parameter Grid Box 

Grid parameter file dapat dilakukan pada Macromolecule (reseptor) dan Set Map Types (ligan). Kemudian diatur koordinat x, y, dan z. Disimpan dalam format GPF dengan nama "grid.gpf" 

Video 6. Mengatur parameter grid box

Note : Ketika validasi metode dikatakan valid, maka proses molecular docking antara senyawa uji dan reseptor menggunakan nilai koordinat x, y, dan z yang sama.

• Mengatur Parameter Docking

Parameter docking dimulai dari Macromolecule (Set Rigid Filename) untuk reseptor, ligand (choose), Search Parameters (Genetic Algorithm, yang diubah hanya Number of GA Runs menjadi 100 kali) serta Docking Parameters.    

Video 7. Mengatur parameter docking

• Running Autogrid4 dan Autodock4

autogrid4.exe dan autodock4.exe dapat didownload pada https://drive.google.com/drive/folders/1AXsLUyzzMNUzPUcq_fZImi8zIZK9yxWi?usp=sharing

Video 8. Running autogrid4 dan autodock4

• Hasil Docking

Hasil docking yang diperoleh berupa free energy binding dan inhibition constant. 

Note : Untuk melihat free energy binding dan inhibition constant berdasarkan cluster Rank yang diperoleh dengan cara Ctrl+F lalu mengetik histogram, klik Find dan lihatlah nila-nilai yang diperoleh. 

Video 9. Hasil docking

• Membandingkan nilai RMSD

 Gambar 1. RMSD hasil kristalografi yang diperoleh dari PDB

Gambar 2. RMSD hasil re-docking

Dari hasil RMSD kristalografi dan re-docking diatas dapat dinyatakan bahwa metode yang digunakan valid dan dapat melakukan proses docking reseptor tersebut dengan senyawa uji. Nilai RMSD hasil re-docking yang makin kecil tersebut menunjukkan posisi yang makin mendekati nilai hasil kristalografi. 

• Visualisasi Hasil Docking

Hasil docking yang diperoleh dapat kita visualisasikan 2D maupun 3D residu asam amino yang terbentuk antara reseptor (protein target) dengan ligan alami (native ligand) maupun ligan uji (senyawa uji) menggunakan Biovia Discovery Studio. Selain itu, dapat pula dilakukan visualisasi dari ligan alami hasil re-docking (grey) dan kristalografi (kuning) dengan tujuan dapat melihat ketika tumpang tindih kedua ligan alami tersebut.

Gambar 3.  Visualisasi ligan alami hasil re-docking (grey) dan kristalografi (kuning)

Video 10. Visualisasi ligan hasil re-docking dan kritalografi

Gambar 4. Visualisasi hasil docking 3D dan 2D

Video 11. Visualisasi hasil docking 

• Ligan Uji (Senyawa Uji) 

Ligan uji diperoleh dari metabolit sekunder tumbuhan, hewan, hasil sintesis, maupun berdasarkan data empiris dari masyarakat yang secara turun-temurun telah menggunakannya. Didownload dari https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ namun jika tidak ditemukan, maka dapat dilakukan secara manual yang digambarkan pada Chem Draw Ultra 12.0 dan diminimisasi energi di Chem3D Pro 12.0

Misalnya, untuk senyawa uji yang aku gunakan dari jenis coral gorgonia. Jenis coral tersebut memiliki potensial sebagai kandidat obat anti-inflamasi. Salah satu metabolit sekunder tersebut adalah gyrosanols A dari Sinularia gyrosa yang didownload pada https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ . 

Video 12. Preparasi ligan uji (senyawa uji) yang didownload dari PubChem

Kemudian aku juga menggunakan metabolit sekunder, 5-epi-sinuleptolide dari Junceella fragilis yang tidak ditemukan di PubChem, maka dilakukan secara manual menggunakan ChemDraw.

Video 13. Preparasi ligan uji yang dilakukan secara manual menggunakan ChemDraw

Setelah dilakukan preparasi ligan uji (senyawa uji) pada ChemDraw dan Autodock Tools, maka proses docking dengan reseptor dapat dilakukan seperti step validasi metode.

Untuk lebih mendetail dari setiap step by step yang dikerjakan, teman-teman dapat membaca: https://www.researchgate.net/publication/344360990_Virtual_Screening_Kandungan_Senyawa_Kipas_Laut_Gorgonia_mariae_sebagai_Antiasma 

Semoga dapat menjadi acuan ketika proses belajar docking yaaa... Aamiin!!!  

Selain itu, kalian dapat pula mendownload tutorial plus aplikasi dari Autodock Vina dan Ligan Scout. Berikut linknya : https://drive.google.com/drive/folders/1dtOGb90sE0-3AKFvWWgzCnC0UV6KlQps?usp=sharing